To evaluate three labeling approaches of chicken primordial germ cells

摘要

在雞胚胎發育早期，始基生殖細胞（Primordial germ cell ; PGC）並非一開始就源自於性腺預定發育的區域，而是從新月區(Germinal crescent)經由血液循環遷移進入生殖脊（Genital ridge），再分化成生殖細胞（Germ cell）。不同物種的始基生殖細胞遷移路徑和分化機制不盡相同;在斑馬魚以及小鼠已成功利用基因轉殖技術標定並追蹤PGC遷移。而在禽鳥類的基因轉殖技術尚未成熟，無法用來追蹤始基生殖細胞的遷移。因此本論文嘗試比較三種不同標定雞的始基生殖細胞的方式，以便未來探討其遷移路徑。方法一為用合成SDF-1 FITC胜肽片段標定帶有CXCR4受體的PGC。方法二嘗試用RCAS鳥類反轉錄病毒將轉殖基因送入性腺;文獻得知幹細胞以及生殖細胞內存在會阻礙RCAS進行反轉錄作用所導致基因靜默 (Gene silencing)的機制，而且很可能經由PBS (Primer binding site)作用，所以利用Quick Change PCR的方式置換了RCAS病毒5’LTR的PBS，再利用顯微注射 (Microinjection)的方式在雞胚胎進行操作。近年來文獻指出將絕緣子放置在病毒3’LTR中以達到阻隔靜默作用延伸到轉殖基因，但會限制病毒嵌入能力以及病毒的產量。因此方法三設計反轉錄病毒Lentiviral載體，改變絕緣子放置於兩端LTR內側以保護Cvh調控序列並結合綠螢光蛋白。經分析後發現，三種方法各有優缺點，但是皆未能達到穩定且專一標定PGC的需求，仍需要進一步改進標定PGC的方法。